pTOP 벡터는 -20°C 또는 -80°C에서 안정적으로 보관할 수 있습니다. 다만, 제품의 안정성을 위해 잦은 freeze-thaw 는 피하시기 바랍니다.

길이가 긴 insert 를 cloning 할 때, Insert DNA를 포함한 plasmid의 전체 길이가 큰 경우 (특히, 10 kb를 넘는 경우)에는 transformation 효율이 현저히 낮아지고, 대장균 내에서의 plasmid 안정성도 떨어지므로, 정확한 clone을 확보하기 어려워집니다. 또한, 손상되지 않은 긴 insert 를 얻기 어려워 cloning 효율이 저하됩니다.

당사는 긴 DNA 단편의 cloning 을 위한 TOPcloner™ XL TA Kit (Cat. EZ033S) 를 보유하고 있으며, 이 제품은 특별한 gel purification 시약이 제공되어 긴 길이의 PCR 산물을 효율적으로 cloning 할 수 있습니다.

TOPcloner™ Kit 의 insert 사용량은 크기에 따라 결정되며, 700 bp 당 20 ng 의 DNA 를 사용하는 것이 좋습니다.

일반적인 DNA ligase 를 사용하는 cloning 방식과 다르게 TOPcloner™ Kit 는 topoisomerase 를 이용합니다. 이런 특성으로 상온에서 5분만에 insert 와 vector 를 연결할 수 있으며, >95% 재조합 산물을 생성합니다.

Taq polmerase와 proofreading polymerase 를 포함하는 nTaq-Tenuto 도 3' A-overhang이 존재함으로 TA Cloning 이 가능합니다. 또한,Pfu polymerase만을 사용하는 경우에도 PCR 후 Taq polymerase로 3' A-overhang을 추가할 수 있습니다. 

TOPcloner™ kit 의 Topoisomerase 특성으로 인해 insert DNA 의 5' 에 phosphate 가 포함되어서는 안됩니다. 따라서 제한 효소로 절단된 DNA 는 TOPcloner™ kit 의 기질로 사용할 수 없습니다.

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TOPcloner™ kit 와 TOPcloner™ core kit 는 구성품이 다릅니다.

 

각 제품의 구성품은 아래와 같습니다.

 

TOPcloner™ TA kit	TOPcloner™ TA core kit
pTOP TA V2 6X TOPcloner™ Buffer 2X TOPsimple™ DyeMIX-Tenuto M13F, M13R (10 pmol/μl) Control insert DNA (20 ng/μl) Control primers (10 pmol/μl each) DH5α Chemically Competent E. coli Sterile water	pTOP TA V2 6X TOPcloner™ Buffer Sterile water

 

최상의 반응을 위해서는 insert 형태에 따라 적절한 kit 사용을 권장합니다.

3’-A overhang insert DNA 는 TOPcloner™ TA kit 를, blunt end insert DNA 는 TOPcloner™ blunt kit 를 사용하시기 바랍니다. TOPcloner™ TA-Blunt kit 는 모든 경우에 대해 약 80% 의 효율을 얻을 수 있습니다. 

pTOP V2 vector 에는 ccdB gene 이 포함되어 self-ligation 시 colony가 사멸합니다.
다만, 제조 과정중에 vector 와 topoisomerase 가 목적한 위치에 정확하게 결합되지 않아서 ccdB gene 이 제대로 기능하지 못하는 경우가 일부 발생할 수 있습니다. 이 때문에 self-ligation 된 vector 를 포함하는 colony 가 생존하게 된다고 예측하고 있습니다. 그럼에도 불구하고, ㈜엔지노믹스는 positive control 대비 self-ligation 된 colony 비율을 2% 미만으로 관리하고 있습니다.

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제공해 드리는 pTOP V2 Vector 안에는 T3, T7 Promoter 가 포함되어 있지 않습니다.

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