1. Nuclease가 오염되었을 수 있습니다. Nuclease 오염의 원인은 DNA, 완충액 또는 물 등이 있을 수 있으며, 각 성분을 새로 준비하여 하나씩 바꿔가며 테스트하여 오염원을 찾아낼 수 있습니다.

2. 특정 제한효소는 DNA에 대한 결합 친화도가 높아서 전기영동 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 이 경우 반응 후 0.1 - 0.5% SDS 용액을 추가하거나, 동봉된 6X DNA loading Buffer를 사용하는 것을 권장합니다.

3. Running 버퍼를 장기간 실온에서 보관하며 재사용하면 전기영동 시 안 좋은 영향을 줄 수 있습니다. 이러한 경우, 버퍼를 새로 만들어 전기영동하는 하는 것이 도움이 될 수 있습니다.​ 

페놀, 클로로포름, 알코올, EDTA, 또는 적절하지 않은 농도의 염은 제한효소의 활성을 방해할 수 있습니다. DNA가 제한효소에 의해 정상적으로 절단되지 않는다면, 절단 부위가 알려진 대조군 DNA에 제한효소를 처리하여 효소 활성 여부를 판단합니다. 대조군 DNA가 절단되고 샘플 DNA가 절단되지 않는 경우 두 DNA를 혼합하여 샘플에 저해제가 존재하는지 확인할 수 있습니다. 반응 저해제 (염, EDTA 또는 페놀)가 존재하는 경우 혼합 후 대조군 DNA조차 절단되지 않습니다.​

일반적으로 제한효소 unit의 정의는 1시간 반응을 기준으로 합니다. 하지만 효소의 양을 늘려 반응 시간을 단축하거나, 적은 양의 효소로도 반응을 완료할 수 있도록 반응 시간을 늘릴 수 있습니다. 일부 효소는 반응 온도에서 장시간 활성이 유지되지만, 짧은 시간동안만 활성을 나타내는 효소도 있기 때문에 효소의 특징을 확인한 후 결정해야 합니다. 또한 반응 조건에 따라 절단하는 서열을 인식하는 특이도가 낮아져 효소가 원래 인식서열과 다른 서열을 절단하는 star activity가 나타날 수 있습니다. 이러한 성질을 갖는 제한효소의 경우 비정상적인 절단을 억제하기 위해 권장 조건에서 사용해야 하므로, 반응 시간을 연장하기 전에 사용하려는 제한효소 정보를 확인해야 합니다.

1. 반응이 완료된 후 정제 과정을 통하여 제한효소를 제거할 수 있습니다.

2. EDTA (final conc.: 10 mM) 를 추가하여 제한효소의 활성을 억제할 수 있습니다. (다음 실험에 영향을 줄 수 있습니다.)

3. 반응액을 -20℃ 이하에서 냉동 보관하십시오. 

㈜엔지노믹스의 FastCut buffer 는 대부분의 엔지노믹스 제한 효소와 함께 사용할 수 있습니다. 

따라서 double digestion 시 FastCut buffer 를 사용하면 쉽게 반응할 수 있습니다. 희석하지 않은 1 ㎕ 의 제한 효소를 FastCut buffer 와 함께 사용하여 15분 내에 1 μg 의 DNA 를 절단할 수 있습니다.

 

<FastCut buffer 적용 가능 여부>

Not recommended	R030	BstX I
	R056	Bal I
	R059	Acc III
	R081	Cfr9 I
	R099	PspG I
	CR016	EZ-CleanCut™ Nhe I
2X concentrated	R002	EcoR I
	R003	BamH I
	R009	Sal I
	R108	BspE I
1X concentrated	The rest of Enzynomics’s restriction enzymes

 

㈜엔지노믹스의 FastCut Buffer 와 타 브랜드의 효소의 혼합 사용은 권장하지 않습니다 

일부 제한 효소는 부적합한 반응 조건에서 인식 서열과 유사한 서열을 절단하거나 비특이적 반응을 보일 수 있는데, 이를 star activity 라고 합니다. star activity 는 극한 조건에서 발생하는 제한효소의 일반적인 특징이며, 그 조건은 다음과 같습니다.

 

1. Star activity 가 발생할 수 있는 조건

다음과 같은 조건에서 star activity 가 발생할 수 있습니다.

1) 5% (v/v) 이상의 높은 글리세롤 농도

2) DNA에 비해 높은 비율의 제한효소 사용량 (각 효소에 따라 다름, 일반적으로 100 unit/μg 이상)

3) 적절하지 않은 반응 Buffer (낮은 이온 농도 또는 높은 pH)

4) 장시간 반응

5) 유기 용매의 존재 (DMSO, ethanol, ethylene glycol, dimethylacetamide, dimethylformamide 등)

6) Mg²⁺ 대신 다른 2가 양이온으로 치환 (Mn²⁺, Cu²⁺, Co²⁺, Zn²⁺)

 

2. Star activity 억제 방법

1) 완전한 절단을 위해 가능한 한 적은 양의 제한효소를 사용하십시오. 이를 통해, 과도한 효소 사용을 피하고, 반응에서 최종 글리세롤 농도를 감소시킬 수 있습니다.

2) 적절한 반응 buffer를 사용하십시오: 일반적인 제한 효소 반응의 적정 pH 는 7.2~8.5, ionic strength 는 50~150 mM 입니다.

3) 반응 용액에 알코올과 같은 유기 용매가 존재하지 않아야 합니다.

4) Mg²⁺ 를 2가 양이온으로 사용하십시오.

 

㈜엔지노믹스는 보다 정확한 실험을 위해 star activity 가 감소된 EZ-CleanCut™ 제한효소를 제공합니다. 

㈜엔지노믹스에서 판매되는 EZ-CleanCut™ 제한효소는 모두 EzBuffer IV 에서 100% 활성을 나타냅니다. 따라서 일반 제한효소와 함께 사용할 수 있습니다.

1. Double digestion 에서 최적의 효소 활성을 보장하면서도 일부 효소의 star activity (비특이반응) 를 감소시기키 위해서는 적합한 buffer 를 선택하는 것이 중요합니다. 

각 효소는 최적의 EzBuffer가 제공되며, EzBuffer I~IV 에 따른 효소 활성 정보가 제공됩니다.

 

2. 각 효소가 최적의 활성을 나타내는 EzBuffer 를 선택하여 반응하시기 바랍니다. 

또한, ㈜엔지노믹스는 대부분의 제한효소와 호환되는 단일 버퍼시스템인 FastCut Buffer 를 제공하고 있습니다. FastCut Buffer 는 double digestion 반응에 사용할 수 있는 매우 편리한 buffer입니다.

 

3. 두 제한효소 모두에 대한 최적의 반응 buffer 를 찾기 어려울 경우, 대체 가능한 EZ-CleanCut™ 제한효소가 있는지 검토하십시오. 

EZ-CleanCut™ 제한효소는 모두 EzBuffer IV 에서 최적 활성을 나타냅니다.

 

4. start activity 를 최소화하기 위해서는 글리세롤의 최종 농도가 5% 미만이어야 합니다. 

따라서, 50 μl 반응에서 첨가되는 총 효소 양은 5 μl 를 초과하지 않도록 하십시오.

 

5. 두 제한효소의 권장 반응 온도가 다른 경우, 첫 번째 효소를 첨가하고 권장 온도에서 반응시킨 후 두 번째 효소를 추가하여 권장 온도에서 반응하십시오.

 

6. 모든 방법에도 불구하고, 함께 반응하기 어려운 경우에는 순차적 반응을 권장합니다. 

염 농도가 낮은 EzBuffer 에서 첫번째 제한효소를 반응하고 높은 염 농도의 buffer 를 추가하여 두번째 제한효소 반응을 수행하십시오.