A :

일반적으로 RNase 가 오염되었거나 DNA template 가 제대로 digestion 이 되지 않았을 경우 끌림 상이 발생할 수 있습니다. DNA template 가 5’ overhang 또는 blunt-end 로 준비되었는지 확인하십시오. 또한 RNase 오염을 방지하기 위한 작업을 수행하십시오. 동봉된 Control DNA 를 사용하여 문제 원인을 파악할 수 있습니다.

 

A :

500 nt 이하의 작은 RNA 도 합성이 가능합니다. 다만, 일반적인 경우보다 효율이 낮을 수 있습니다. 이 때 반응시간, Template 농도, T7 RNA Polymerase 사용량 등을 조정하면 결과가 개선될 수 있습니다. 자세한 방법은 제품별 사용설명서를 참고해주시기 바랍니다.

A :

합성된 RNA 는 사용자의 선택에 따라 Prep kit, Spin column chromatography, Phenol : chloroform extraction, Lithium Chloride precipitation 등 다양한 방법으로 정제할 수 있습니다. EZ™ T7 In Vitro mRNA Synthesis Kit 와 EZ™ MEGA T7 Transcription Kit 는 Lithium Chloride precipitation 에 필요한 Lithium Chloride (LiCl) 와 Phenol : chloroform extraction 과정에 필요한 Ammonium Acetate Stop Solution 을 제공합니다.

 

1) LiCl 을 이용한 정제는 합성 후 반응액에 남아있는 nucleotide 와 protein, salt 를 편리하고 효율적으로 제거할 수 있는 방법입니다. 방법은 아래와 같습니다.

① 반응액에 LiCl 50 μl 를 넣고 완전히 혼합합니다.

② -20℃ 에서 30분 이상 유지합니다.

③ 가능한 최대 속도로 4℃ 에서 15분간 원심분리 합니다.

④ 상층액을 조심스럽게 제거합니다.

⑤ 세척을 위해 70% 에탄올 700 μl 를 넣고 위와 같은 조건으로 재 원심분리 합니다.

⑥ 에탄올을 완벽하게 제거한 후 준비해 둔 버퍼나 RNase-free water 로 RNA pellet 을 현탁 합니다.

• LiCl 을 넣기 전 반응액을 물에 희석하지 마십시오.

• 300 bp 보다 작은 사이즈는 정제 효율이 떨어집니다

 

2) Phenol : chloroform extraction 을 이용한 RNA 정제는 고전적이면서 가장 확실한 정제 방법입니다. RNA 가 침전되어 버퍼 교환을 할 수 있는 방법이기도 합니다.

①반응액에 Ammonium Acetate Stop Solution 10 μl 을 넣고 완전히 혼합합니다.

②동일용량만큼 phenol/chloroform 을 넣고 이어서 동일양의 chloroform 을 넣습니다.

③ 수용상의 용액을 회수하여 새튜브 로옮기고 동일양의 isopropanol 을 넣어 잘 혼합합니다.

④ -20℃에서 15분이상 유지한 뒤 가능한 최대속도로 4℃에서 15분간 원심분리합니다.

⑤ 상층액을 제거한 뒤 준비해둔 버퍼나 RNase-free water 로 RNA pellet 을 현탁합니다.

 

㈜엔지노믹스의 EZ™ Total RNA Miniprep Kit (from cultured cells) 는 이 실험에 적합하지 않습니다. 

A :

적절한 promoter가 포함된 Blunt-end PCR Product 는 사용할 수 있습니다.

A :

- EZ™ T7 In Vitro mRNA Synthesis Kit 와 EZ™ MEGA T7 Transcription Kit 에는 DNase I 이 포함되어 있습니다. Transcription 반응 후 반응액에 동봉된 DNase I 을 2 μl 첨가하고 37℃에서 15분간 반응하면 DNA를 제거할 수 있습니다.

 

- EZ™ T7 High Yield In Vitro Transcription Kit 는 별도의 DNase I (Cat. M059) 를 구매하셔야 하며, DNase I 을 1~2 unit 첨가하고 37℃에서 15분간 반응하면 DNA를 제거할 수 있습니다. 이때 10X DNase I buffer 는 사용하지 않으셔도 됩니다. 

A :

두 제품 모두 1 μg 의 DNA 로부터 최대 180 μg 의 RNA를 합성할 수 있는 동등한 성능의 제품입니다. 다만, EZ™ MEGA T7 Transcription Kit 에는 합성된 RNA 를 정제할 수 있도록 Lithium Chloride Precipitation Solution 와 DNase I 이 함께 제공되며, PreMIX 형태로 제공되어 실험에 좀 더 편리한 장점이 있습니다.