비특이적인 PCR 산물이 발생하면 아래 사항을 참조하십시오.

- 비특이 결합을 피하기 위해 더 긴 primer 를 사용하고 3' 말단에서 3개의 연속적인 G 또는 C nucleotides 를 피하세요.

- 특이성을 높이기 위해 annealing 온도를 높이세요.

- Mg²⁺농도를 낮춰서 사용해보세요.

- UDG 를 사용하여 교차 오염을 피하세요. 당사는 UDG가 포함된 PCR 제품들을 제공합니다.

PCR 산물의 양을 늘리려면 아래 사항을 참조하십시오.

- Polymerase 사용량이 부족하거나 또는 PCR 반응액에 저해제가 존재할 수 있습니다.

- Hot-start 제품의 경우 initial denaturation 시간이 충분하지 않으면 PCR 중합효소가 100% 활성화 되지 않을 수 있습니다.

- Denaturation 및 extension 온도가 너무 높아서 polymerase 활성이 조기에 끝날 수 있습니다.

- Pimer가 잘못 설계되었거나 annealing 온도가 잘못 설정되었을 수 있습니다.

- 원하는 산물의 크기에 비해 짧은 extension 시간을 설정했을 수 있습니다.

- PCR cycle이 너무 적을 수 있습니다

- Mg²⁺가 부족하거나 너무 많습니다

- 너무 많은 DMSO가 포함되어 있을 수 있습니다.

- Denaturation 이 불완전할 수 있습니다. 높은 온도에서 충분한 시간동안 반응하십시오.

- Annealing 온도가 잘못 설정되었을 수 있습니다. Primer 의 Tm 을 확인하여 적절한 온도를 설정하십시오.

- Template 의 GC 비율이 높을 수 있습니다. 당사의 nTaq-Tenuto, nTaq-HOT, RbTaq Tenuto HOT, RbTaq HOT 에 포함된 GC Melt 를 사용하십시오.

- 반응액에 Taq DNA 중합효소의 저해제가 존재할 수도 있습니다. PCR에 BSA를 추가하거나, Taq의 양을 늘리거나, PCR 반응액의 부피를 늘려 저해제를 희석하십시오.

- GC 함량이 높은 template을 층폭할 경우 DMSO를 첨가해 볼 수 있으나 10% 이상 고농도의 DMSO는 Taq의 반응을 억제할 수 있습니다. 

PCR 이후 전기영동에서 번짐현상은 아래와 같은 이유로 발생할 수 있습니다.

- PCR cycle을 너무 많이 진행했을 수 있습니다. 

- 사용 중인 pimer 에 비해 annealing 온도가 낮을 수 있습니다.

- Annealing 또는 extension 시간이 너무 길었을 수 있습니다.

- primer가 오염되거나 오래됐을 수 있습니다.

- 너무 많은 template가 사용되었을 수 있습니다.

- Polymerase, primer, Mg²⁺ 및/또는 dNTP 농도가 너무 높을 수 있습니다.

보통 target DNA 의 GC 함량이 65% 이상일 때 GC-rich 하다고 볼 수 있습니다. GC-rich 영역은 inverted repeat 에 존재하거나 hairpin 구조를 형성하는 경향이 있어, denaturation 후 annealing 과정에서 단일가닥으로 분해된 주형 DNA의 base-paring으로 인해 2차구조가 형성될 수 있습니다. 이러한 2차구조에 의해 polymerase의 합성이 중간에 멈춰 불완전한 형태의 증폭 산물이 발생하게 됩니다. GC rich PCR 의 경우, 당사의 nTaq-Tenuto, nTaq-HOT, RbTaq Tenuto HOT, RbTaq HOT 에 포함된 GC Melt 를 사용하면 도움이 될 수 있습니다. 동봉된 GC Melt I, II 를 각각 전체 반응액의 1/5, 1/10, 1/20 정도 첨가하여 개선된 결과를 확인하시기 바랍니다.

긴 PCR target를 효율적으로 증폭하기 위해서는 annealing 시간, 효소 반응액의 pH, 염 농도, primer design, DNA 샘플의 순도, 효소의 증폭 효율 및 proofreading 여부 등 여러 변수를 고려하여야 합니다.

DNA 정제과정에서 DNA 가 분해되거나 높은 온도와 낮은 pH 조건에서 DNA depurination 등이 일어나 DNA가 손상될 경우, 원래의 길이보다 짧은 DNA 단편의 증폭률이 늘어나며 전체 증폭 산물을 감소시킵니다.

효소의 증폭 효율도 주요한 조건이며, 당사는 긴 타겟의 증폭도 가능한 nTaq-Tenuto, RbTaq-Tenuto Hot, nPfu-Forte, nPfu-Special 등을 제공하고 있습니다.

Mg²⁺은 Taq DNA polymerase의 cofactor로 작용하며 효율적인 DNA 증폭에 매우 중요한 요소입니다. Mg²⁺ 농도가 낮으면 PCR 효소의 활성이 감소할 수 있으며, 반대로 농도가 높으면 효소의 정확성이 감소하여 비특이적인 DNA가 증폭될 수 있습니다. 샘플에 포함된 EDTA 또는 구연산염, 주형 DNA의 농도, dNTP 농도와 단백질 유무 등 다양한 요소가 Mg²⁺ 농도에 영향을 줄 수 있으므로 반응에 최적인 Mg²⁺ 농도를 찾아야 합니다. 당사의 nTaq (Mg2+ Free) (Cat. P025B) 과 nTaq-Tenuto (Mg2+ Free) (Cat. P225B) 는 25 mM MgCl₂ 를 별도로 제공하여, Mg²⁺ 농도를 조정할 수 있습니다.  

1) 3-step PCR

일반적인 PCR이나 짧은 단편 (< 4kb) 증폭 시 주로 사용합니다. 3-step PCR은 denaturation, annealing, extension 과정으로 진행됩니다.

primer의 Tm값이 62℃보다 낮은 경우에는 3 step PCR 을 사용해야 합니다.

2) 2-step PCR

primer 의 Tm 값이 높거나, 증폭 산물이 길 때 (> 4kb) 주로 사용합니다. 2-step PCR은 denaturation 후 annealing & extension이 한 단계로 진행됩니다.

낮은(68℃) extension 온도는 증폭에 영향을 줄 수 있는 depurination 확률을 낮춰 긴 단편의 증폭수율을 개선할 수 있습니다.

PCR 은 매우 높은 감도의 검출 방법이므로, 앞서 진행한 PCR 증폭산물의 carryover contamination 에 의해 위양성 (false positive) 증폭 결과를 나타낼 수 있습니다. UDG 는 이런 위양성 증폭을 제거하는 효과가 있습니다. PCR 시 dTTP 와 dUTP 를 혼합하여 사용하면 uracil 를 포함하는 U-product 가 생성됩니다. uracil DNA glycosylase (UDG) 는 이런 PCR 증폭 산물 (U-product) 의 uracil 를 제거하여 carryover contamination 된 DNA 를 제거합니다. 오염된 증폭산물이 제거되면 uracil 을 포함하지 않는 진정한 검체 유래의 DNA template 로 사용되며, 이와 같은 원리로 반복적인 PCR 시 carryover 오염을 방지할 수 있게 됩니다.

nTaq-Tenuto 는 proofreading 활성을 보유하고 있습니다. 일반 Taq polymerase 보다 더 높은 정확성을 가지면서도 3’-A overhang PCR product 를 생성하도록 설계되었습니다.

GC melt 는 GC 비율이 높은 template 를 증폭할 때 결과 개선에 도움이 되는 시약입니다.

GC melt I 과 GC melt II 의 조성 및 적용 결과가 다르기 때문에, 처음 시약을 사용할 때에는 각각의 시약을 반응액의 1/5, 1/10, 1/20 농도로 사용하여 사전 실험을 수행한 후, 이를 바탕으로 적정 시약 및 농도를 선택하여 사용하시기 바랍니다. 

Characteristics of Enzynomics PCR polymerases  

Selection guide of Enzynomics PCR polymerases