A :

PCR 은 매우 높은 감도의 검출 방법이므로, 앞서 진행한 PCR 증폭산물의 carryover contamination 에 의해 위양성 (false positive) 증폭 결과를 나타낼 수 있습니다. UDG 는 이런 위양성 증폭을 제거하는 효과가 있습니다. PCR 시 dTTP 와 dUTP 를 혼합하여 사용하면 uracil 를 포함하는 U-product 가 생성됩니다. uracil DNA glycosylase (UDG) 는 이런 PCR 증폭 산물 (U-product) 의 uracil 를 제거하여 carryover contamination 된 DNA 를 제거합니다. 오염된 증폭산물이 제거되면 uracil 을 포함하지 않는 진정한 검체 유래의 DNA template 로 사용되며, 이와 같은 원리로 반복적인 PCR 시 carryover 오염을 방지할 수 있게 됩니다.

A :

nTaq-Tenuto 는 proofreading 활성을 보유하고 있습니다. 일반 Taq polymerase 보다 더 높은 정확성을 가지면서도 3’-A overhang PCR product 를 생성하도록 설계되었습니다.

A :

GC melt 는 GC 비율이 높은 template 를 증폭할 때 결과 개선에 도움이 되는 시약입니다.

GC melt I 과 GC melt II 의 조성 및 적용 결과가 다르기 때문에, 처음 시약을 사용할 때에는 각각의 시약을 반응액의 1/5, 1/10, 1/20 농도로 사용하여 사전 실험을 수행한 후, 이를 바탕으로 적정 시약 및 농도를 선택하여 사용하시기 바랍니다. 

A :

Characteristics of Enzynomics PCR polymerases  

Selection guide of Enzynomics PCR polymerases 

A :

네, 80 °C 에서 20 분간 반응하여 inactivation 시킬 수 있습니다.

​

A :

각 primer의 권장 최종 농도는 다음과 같습니다.

FIP/BIP Primers (1.6 µM), F3/B3 Primers (0.2 µM), LoopF/B Primers (0.4 µM)​ 

A :

네, 그러나 reverse transcription 을 위해서는 각각의 타겟에 대한 사전 실험을 통해 적용 가능 여부를 확인해야 합니다. 대안으로, reverse transcriptase 와 혼합하여 사용할 수 있습니다.

​

A :

Bst DNA Polymerase (Full length) 는 5’→3’ exonuclease (double-strand specific) activity 를 가지는 반면, Bst DNA Polymerase (Large Fragment) 는 strand displacement activity 를 가지고 있습니다.

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A :

TBE buffer는 제품의 특성상 침전물이 발생할 수 있습니다.

다음과 같은 방법을 이용하여 문제를 해결할 수 있습니다.

 

1) 110 °C에서 5분 이상 autoclave 하여 미세한 침전물을 용해시킬 수 있습니다

  (제품의 용기는 autoclave에 적합하지 않습니다. 필요한 경우 버퍼를 유리 병에 옮겨 사용하십시오.)

 

2) 0.2 μm cellulose acetate 또는 cellulose nitrate filter 로 여과하여 사용할 수 있습니다. 

A :

1) Template 오염

DNA 또는 RNA의 보관상태, 오염에 따라 PCR 반응이 제대로 이뤄지지 않을 수 있습니다. 이 경우 Template를 새로 준비하는 것이 좋습니다

 

2) 잘못된 Primer, Probe

잘못된 Primer 설계로 인해 PCR 반응이 이뤄지지 않을 수 있습니다.

 

3) PCR polymerase 효율 저하

PCR 중합효소가 100% 활성화 되지 않을 수 있습니다. TOPreal™ qPCR PreMIX​ 는 최소 10분 이상의 initial denaturation을 통한 충분한 활성화가 필요합니다.

A :

Dye-based qPCR (예: SYBR Green)은 별도의 probe가 필요하지 않으므로 비용적으로 효율적인 qPCR 방식입니다. 그러나 intercalating dye 는 반응에서 생성된 모든 dsDNA를 감지하기 때문에 비특이적인 증폭 및 비주형 증폭(NTC)이 관찰될 수 있습니다. 따라서 PCR 후 수행된 melting curve 을 사용하여 올바른 산물과 비특이적 산물을 구별해야 합니다. 또한 증폭된 모든 DNA가 동일한 형광으로 표지되므로 dye-based qPCR 에서는 multiplex PCR을 수행할 수 없습니다.

 

Probe-based qPCR (예: TaqMan)은 일반적인 PCR primer 외에 형광 표지된 서열 특이적 probe가 필요합니다. 이에 분석 비용은 증가하지만, 특이성이 높으며 NTC 증폭으로 인한 부정확한 정량을 초래할 가능성이 낮습니다.  또한 고유한 형광으로 표지된 다양한 probe를 설계할 수 있으므로 multiplex PCR 이 가능합니다. 다만, 서열 특이적 probe에 사용하는 probe-based qPCR 이 dye-based qPCR 시약 분석보다 더 민감한 것처럼 보일 수 있지만 잘못 설계된 probe는 intercalating dye 보다도 덜 특이적일 수 있습니다.

 

A : One-step RT-PCR은 편리하고 피펫팅 오류의 가능성이 적기 때문에 오염이 덜 발생하며 Two-step 보다 빠르지만, 합성된 cDNA는 보관할 수 없습니다. Two-step RT-qPCR은 cDNA를 보관하고 여러 유전자를 동시에 분석할 수 있는 장점이 있습니다.

A :

절대 정량은 copy 수를 이미 알고 있는 표준 DNA (혹은 RNA)를 이용하여 미지의 샘플에 포함된 target DNA(혹은 RNA)의 절대적인 양을 결정하는 정량 방법입니다.

상대 정량은 샘플 간의 상대적인 비교를 위해 사용하는 정량 방법으로, 대조군 샘플과 미지의 샘플의 유전자 발현량을 비교하는 실험에 응용됩니다. 

일반적으로 상대 정량은 target 유전자를 정량하고, reference 유전자 (예를 들면 housekeeping gene)을 동시에 사용하여 정규화시킵니다.

 

A :

TOPreal™ SYBR Green qPCR PreMIX은 버퍼 조성상 보관 온도(-20℃)에서 낮은 확률로 결정이 생기기도 합니다. 약간의 열을 가하면 바로 녹기 때문에 제품에는 문제가 없습니다. 결정이 생기셨을 때는 손으로 살짝 움켜쥐어 녹인 뒤 vortexing으로 잘 혼합하여 사용하시길 권장 드립니다. 

A :

1. Nuclease가 오염되었을 수 있습니다. Nuclease 오염의 원인은 DNA, 완충액 또는 물 등이 있을 수 있으며, 각 성분을 새로 준비하여 하나씩 바꿔가며 테스트하여 오염원을 찾아낼 수 있습니다.

2. 특정 제한효소는 DNA에 대한 결합 친화도가 높아서 전기영동 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 이 경우 반응 후 0.1 - 0.5% SDS 용액을 추가하거나, 동봉된 6X DNA loading Buffer를 사용하는 것을 권장합니다.

3. Running 버퍼를 장기간 실온에서 보관하며 재사용하면 전기영동 시 안 좋은 영향을 줄 수 있습니다. 이러한 경우, 버퍼를 새로 만들어 전기영동하는 하는 것이 도움이 될 수 있습니다.​