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Troubleshooting of PCR reactions (ver. Kor)

Table 1. PCR Troubleshooting

PCR 안될

원인

해결책

증폭 없는 주형 DNA

(, 높은 GC 함량을 갖는 주형 DNA)

DMSO (2~5%) 첨가하고 효소 농도를 0.5 unit 으로 감소시킵니다.

Tm 감소시키는 다른 유기 용제를 사용합니다.

주형(template) DNA 문제

주형 DNA 농도, 품질 순도를 검사합니다.

주형 DNA 전기영동에 의해 분해되지 않았는지 확인합니다.

시험에 성공한 쌍의 primer PCR 수행합니다.

새로운 주형 DNA 준비합니다.

낮은 농도의 중합효소

효소 농도를 0.5 unit 단위로 증가시킵니다.

필요한 경우 100 μl 반응에서 효소의 양을 5 unit까지 증가시킵니다.

낮은 농도의 MgCl2

MgCl2 농도를 0.25 mM까지 늘리세요.

부적절한 PCR cycles

annealing 온도를 낮추십시오.

PCR cycle 수를 늘리십시오.

최종 extension 단계 (72, 5) 수행되었는지 확인하십시오.

부적합한 primers

새로운 primer 준비하세요.

부적절한 primer 농도

개의 primer 같은 농도로 사용하십시오.

최적의 농도 (0.1~0.6 μM) 맞게 primer 적정하십시오.

Primer 품질 보관

primer 분해되지 않았는지 확인하십시오.

-15 ~ -30 에서 primer 보관하십시오.

primer dimers 형성

Hot-start PCR 수행하십시오.

PCR 혼합물을 2 개의 혼합물로 나누고 반응 직전에 결합하십시오.

 

특이적인 PCR 결과

원인

해결책

낮은 annealing 온도

primer 염기 서열의 길이에 따라 annealing 온도를 증가 시키십시오.

낮은 농도의 primers

또는 부적절한 primers

primer 최적으로 설계되었는지 확인하십시오.

0.1~0.6 mM 사이에서 적정에 의한 최적의 농도를 결정하십시오.

동일한 농도의 primer 사용하십시오

*nested PCR 수행하십시오.

증폭 없는 주형 DNA

(, 높은 GC 함량을 갖는 주형 DNA)

DMSO (2~5%) 첨가하고 효소 농도를 0.5 unit 으로 감소시킵니다.

Tm 감소시키는 다른 유기 용제를 사용합니다.

주형(template) DNA 문제

연속적으로 희석한 주형 DNA 사용하십시오.

*Nested PCR: 1 PCR에서 얻은 증폭 산물을 주형으로 증폭된 산물 내에서 annealing 하도록 설계된 다른 쌍의 primer 이용한 PCR

 


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