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Overview of PCR polymerases (ver. Kor)

PCR 중합 효소의 개요

1. 중합효소 연쇄반응(PCR)의 원리와 응용

1985 Cetus Biotechnology Company 의 생화학자인 Kary Banks Mullis 박사가 PCR (Polymerase Chain Reaction)이라는 혁신적인 DNA 증폭 방법을 처음 개발했습니다. PCR 법은 매우 적은 양의 주형 DNA 에서 특정 DNA 영역을 증폭하기 위해 다음 3 단계 과정을 반복합니다: (1) 주형 DNA의 변성(denaturation), (2) 프라이머(Primer) 결합(annealing), (3) 중합 효소에 의한 DNA 합성. PCR 법은 분자 생물학, 미생물학, 의학 및 법의학을 포함한 생물학 및 의학 분야의 새로운 영역을 열었으며, 유전병을 분석하고 박테리아 또는 바이러스 감염을 진단하는 데 널리 사용되며, 혈액 한 방울 또는 단일 모발로 범죄자를 찾을 수도 있습니다.

 

2. PCR 증폭 효율에 영향을 미치는 매개 변수

PCR의 최적 조건은 각 PCR 반응에 따라 달라질 수 있습니다. 원하는 DNA 단편을 가장 효율적으로 증폭하기 위해서는 PCR의 각 매개 변수를 조정해야 합니다. PCR 반응의 효율에 영향을 미치는 공통 매개변수는 반응 시간, 반응 온도, 중합 효소의 양 및 유형, 기질 DNA의 양, dNTP Mg2+ 등이 있습니다.

 

1) PCR 중합 효소

최적의 PCR 중합 효소 사용량은 100 μl 반응 부피에서 1~5 unit 의 범위입니다. 일반적으로 중합효소의 사용량은 2.5 unit 이 적당하며, 과량으로 사용할 경우 비 특이적 증폭 산물의 양이 증가 할 수 있고 너무 적은 양을 사용 할 경우 PCR 산물이 적게 생성됩니다.

㈜엔지노믹스의 nTaq (Cat. P025) 은 분당 1 kb 를 합성합니다. 95℃ 에서 nTaq 의 반감기는 50 분입니다. nPfu-Forte 95℃ 에서 60 분 동안 95% 이상의 활성을 유지하며 열 안정성이 우수합니다.

 

2) Mg2+

Mg2+ 의 최적 농도는 1.5~5 mM 입니다. 일반적으로 1.5 mM Mg2+ 을 사용할 경우 dNTP 0.2 mM 이 적정 사용량입니다. PCR 증폭에 사용된 Mg2+ 의 농도는 PCR 중합 효소의 활성, 합성된 DNA 의 충실도(fidelity) 및 프라이머 결합에 영향을 미칩니다. Mg2+ chelating dNTP 를 활성화시키는 데 필요하기 때문에 많은 양의 dNTP EDTA 가 반응 혼합물에 존재할 경우 Mg2+ 농도도 증가시켜야 합니다.

 

3) dNTP

dNTP (deoxyribonucleotides triphosphates) 의 농도는 50~500 μM 이 적절하며 200 μM 이 가장 일반적으로 사용됩니다. 고효율 PCR 을 위해서는 4가지 dNTP 의 농도는 동일한 것이 좋습니다. 낮은 농도의 dNTP PCR 반응의 특이성과 충실도를 증가시킬 수도 있습니다. dNTP 의 농도가 증가하면 Mg2+ 의 농도도 함께 증가하여 사용해야 합니다. PCR 반응동안 dNTP 는 일정한 비율로 소모되지 않습니다. 50 cycle PCR 반응 후, 50% dNTP 가 반응 혼합물에 그대로 남아있게 됩니다.

 

4) 주형(template) DNA

100 μl PCR 혼합물 반응 시 주형 DNA의 권장량은 플라스미드 DNA 또는 DNA 단편은 0.1~30 ng, genomic DNA 50~500 ng 입니다. PCR을 통해 105~106 분자의 DNA 를 쉽게 얻을 수 있습니다. 주형 DNA PCR 반응 저해제(inhibitor) 가 존재할 경우 PCR 증폭효율이 낮아 질 수 있습니다.

 

5) 프라이머(Primer)

프라이머 디자인은 PCR 반응에서 원하는 DNA 단편의 성공적인 증폭을 위한 핵심 요소입니다. 프라이머는 주형 DNA 의 특정 서열에 annealing 할 수 있도록 설계하는 것이 중요합니다. 프라이머가 관심 서열의 다른 영역과 상동성(homology)이 있다면, 비 특이적 DNA 도 증폭될 가능성이 있기 때문입니다. 프라이머의 적절한 농도는 0.1~0.6 μM 입니다. 프라이머를 과량으로 사용할 경우 비 특이적인 DNA 증폭 또는 프라이머 이합체(dimer)가 형성 될 수 있습니다. 프라이머의 권장 길이는 15~30 bp 입니다. 최적의 PCR 효율을 위해서는 GC 함량이 40~60% 이내이어야 하며 두 프라이머의 Tm 은 유사해야 합니다. 프라이머의 3' 말단은 비 특이적 증폭을 피하기 위해 3 개 이상의 연속적인 G 또는 C 를 포함하지 않아야 하며 두 프라이머의 3' 말단은 프라이머 이합체의 형성을 방지하기 위해 서로 상보적이지 않아야 합니다. 또한 주형 DNA 에 안정한 annealing 을 위해 프라이머의 3' 말단은 AT 가 많은 서열을 포함하지 않아야 합니다.

 

6) 반응 온도

6-1) 초기 변성(Initial denaturation)

이중 가닥 주형 DNA 를 단일 가닥 DNA 로 전환시키기 위한 단계입니다. 94~95℃ 의 온도로2~3 분간 가열하는 것이 일반적입니다. , hot-start PCR 중합효소를 사용한 경우 PCR 중합효소의 활성화를 위해 충분한 시간이 필요합니다.

 

6-2) PCR 사이클 중 변성(Denaturation)

반복되는 PCR cycle 중 초기단계로 20~30 초 동안 94~95℃ 반응으로 이중가닥 DNA 를 단일가닥 DNA 로 분리시키는 단계입니다. 반응시간이 너무 길어질 경우 PCR 중합효소의 활성 감소로 인하여 PCR 반응의 효율이 감소 될 수 있습니다.

 

6-3) 결합(Annealing)

프라이머가 주형 단일 가닥 DNA 에 결합하는 단계입니다. annealing 온도는 프라이머 서열의 Tm 에 의존하며 일반적으로 프라이머의 Tm 보다 약 5℃ 낮게 설정하는 것이 바람직합니다. Annealing 온도를 너무 높게 설정할 경우 PCR 효율이 저하 될 수 있으며, 낮게 설정 할 경우 비특이 반응의 원인이 됩니다.

 

6-4) 신장(Extension)

프라이머 annealing PCR 중합효소에 의해 실제적인 DNA 합성이 이루어지는 단계입니다. 일반적인 PCR 중합 효소는 72℃에서 반응하며, 1 kb DNA 단편을 증폭하는 데 1 분의 신장 시간이 필요합니다.

 

7) PCR 주기 수

대부분의 경우 25~35 cycle 이 적절합니다. PCR cycle 수를 늘릴 경우 비 특이적인 DNA 가 증폭 될 수 있으나, 주형 DNA 의 양이 제한적일 경우 40~45 cycle 까지 반응할 수 있습니다. 이론적으로 PCR 반응의 각 주기는 증폭된 DNA 생성물의 양을 배가 시킵니다 (2n, n = PCR cycle 의 수). 그러나 DNA 증폭의 실제 양은 비효율적인 annealing, 증폭에 사용할 수 있는 dNTP 의 감소 및 중합 효소 활성 감소와 같은 많은 이유로 이론보다 낮습니다. 이것을 plateau effect’ 라고 합니다.

 

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